В
основе образования опухоли лежит избыточное размножение определенных
клеток. Совершенно естественно поэтому, что нарушения регуляции
клеточного цикла являются неотъемлемым и основополагающим признаком
неопластической клетки. "Мотором" клеточного цикла, как известно,
служат активности последовательно сменяющих друг друга циклинзависимых
киназ [16] (рис. 1). Каждая циклинзависимая киназа (Сdk) представляет
собой каталитическую субъединицу холоферментного комплекса, для
активности которой требуется присутствие активаторной субъединицы -
циклина. Регуляция активности Сdk осуществляется за счет направленного
изменения уровня определенных циклинов в определенные фазы клеточного цикла. Кроме того, активность Сdk регулируется изменениями фосфорилирования их определенных аминокислотных остатков. В активной форме комплексы циклин-Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие протекание данной фазы.

|
Рис. 1.
Движение по клеточному циклу определяется последовательной активацией
различных комплексов циклин - Cdk. Большинство из них - мишени
активирующего действия онкогенов или ингибирующего действия опухолевых
супрессоров |
Оказалось, что действие многих
протоонкогенов и опухолевых супрессоров направлено на регуляцию тех или
иных комплексов циклин - Cdk. Белковые продукты большинства из них
повышают активность циклинзависимых киназ, ответственных за начальные
этапы пресинтетической фазы G1 (комплексы циклинов D1 - D3 c Сdk4 или
Сdk6 в зависимости от типа клеток) и переход из G1 в фазу синтеза ДНК
(циклин E - Сdk2) (рис. 1). Кроме того, некоторые протоонкогены и
опухолевые супрессоры регулируют активность комплексов циклин А - Сdk2
(требуется для репликации ДНК) и циклин B - Cdk1 (другое название Cdk1
- Cdc2, необходима для перехода из G2 в митоз).
Основным субстратом комплексов
циклин D - Cdk4 и циклин D - Cdk6 является опухолевый супрессор pRb и
Rb-подобные белки р105 и р130. pRb и его гомологи дефосфорилированы в
неделящихся клетках и в пролиферирующих клетках, находящихся в ранней
G1-фазе [17]. В таком состоянии они связывают и блокируют
транскрипционные комплексы E2F - DP (E2F-1,-2, -3, -4, -5 и DP-1, -2,
-3), регулирующие активность ряда генов, продукты которых необходимы
для начала и прохождения S-фазы. В частности, E2F-DP регулируют
экспрессию генов тимидинкиназы, дигидрофолатредуктазы, циклина Е,
циклина А, PCNA, ДНК-полимеразы aльфа и др. [18]. Связывание белков
семейства E2F c pRb ингибирует их транскрипционную активность. При
митогенных сигналах, вызываемых ростовыми факторами, pRb в середине
G1-фазы фосфорилируется комплексом циклин D - Сdk4 (или циклин D -
Cdk6), что вызывает высвобождение транскрипционных факторов E2F - DP из
комплекса с pRb и их активацию [17]. Одним из следствий этого является
стимуляция транскрипции гена циклина Е, в результате чего активируются
комплексы циклин Е - Cdk2, также фосфорилирующие pRb. Таким образом,
возникает регуляторная петля, поддерживающая активность
транскрипционных факторов E2F - DP и контролируемых ими генов,
обеспечивающих репликацию ДНК (см. рис.2). После завершения S-фазы pRb
переходит в дефосфорилированное состояние, в котором он блокирует
активность E2F - DP и вход в следующую S-фазу (для ее инициации
необходим новый митогенный стимул, активирующий комплексы циклин D -
Cdk4,6). Таким образом, опухолевый супрессор рRb играет ключевую роль в
регуляции вхождения клетки в S-фазу.
Продукты многих протоонкогенов
являются компонентами сигнальных путей, ответственных за активацию
комплексов циклин D - Cdk4(6) и циклин E - Cdk2 в ответ на действие
ростовых факторов и/или адгезию клеток к белкам внеклеточного матрикса
(рис. 2). Так, связывание рецепторов ростовых факторов со своими
лигандами индуцирует димеризацию и аутофосфорилирование рецепторов
(одна субъединица димера фосфорилирует другую по тирозинам). Это, в
свою очередь, вызывает взаимодействие рецепторных тирозинкиназ со
многими сигнальными белками, содержащими SH2-домены и связывающими
фосфотирозин. Например, активированные рецепторы фактора роста из
тромбоцитов (PDGF-Rb) взаимодействуют с SH2-доменами таких белков, как
фосфатидилинозитол-3'-киназа (PI3K), фосфолипаза С (PLC)-g1, латентные
формы транскрипционных факторов STAT и адаптерный белок Grb2, передающий сигнал к белкам Ras
[19-21]. Связывание каждого из этих белков с фосфотирозинами рецептора
вызывает активацию пересекающихся сигнальных путей, завершающуюся
активацией в ядре набора транскрипционных факторов и экспрессией
специфических генов (рис. 2). В частности, индуцируемый Grb2 переход
белков Ras в активированное (GTP-связанное) состояние ведет к
стимуляции ряда его эффекторов, в том числе серин-треониновых киназ
Raf* и MEKK, запускающих МАР (Mitogen Activated Protein) киназные
каскады [20,22]. Конечные продукты этих каскадов, ERK (MAPK), р38 и JNK
(SAPK), транслоцируются из цитоплазмы в ядро, где они фосфорилируют и
активируют множество субстратов, в том числе такие транскрипционные
факторы как, Elk1, Ets1*, Ets2*, Jun*, ATF2, Tcf и др. Это, в свою
очередь, вызывает активацию ряда других факторов транскрипции. Так,
Elk1, формируя комплекс с SRF (Serum Response Factor), инициирует
транскрипцию генов, содержащих в своем промоторе SRE элементы, например
гена FOS*.

|
Рис. 2.
Продукты многих протоонкогенов и опухолевых супрессоров регулируют
активность циклинзависимых киназ, фосфорилирующих pRb. Фосфорилирование
pRb, как и его связывание с рядом вирусных онкобелков, вызывает
высвобождение и активацию транскрипционных комплексов E2F - DP,
повышающих экспрессию генов, продукты которых необходимы для
прохождения S-фазы |
Сходные реакции наблюдаются и
при связывании интегринов (рецепторов, опосредующих адгезию клетки) с
белками внеклеточного матрикса. Такое взаимодействие вызывает активацию
и аутофосфорилирование киназы FAK (Focal Adhesion Kinase), в результате
чего она связывается с SH2-доменом протоонкобелка Src, что, в свою
очередь, вызывает рекрутирование адаптерного белка Grb2, активацию Ras
и МАР киназных каскадов (рис.2).
Следствием изменений активности
ряда транскрипционных факторов, индуцируемых активацией МАР-киназ,
является повышение экспрессии гена циклина D1 (предполагается, что за
это ответственны белки Jun, Ets1, Ets2 [21]). Кроме того, митогенные
сигналы повышают экспрессию Myc, что также вызывает увеличение
активности циклинзависимых киназ, оперирующих в G1 (циклин D - Cdk4 и
циклин Е - Cdk2). Это связано с тем, что Myc, во-первых,
трансактивирует ген Cdc25a - фосфатазы, снимающей ингибиторное
фосфорилирование Cdk2 и Cdk4 по Thr-14 и Tyr-15, а во-вторых, понижает
экспрессию ингибитора Сdk2, p27KIP1a
[23-26]. Механизмы активации Myc при действии ростовых факторов изучены
пока плохо. Предполагается, что к ней могут приводить как
Ras-независимые сигнальные пути, активируемые онкобелком Src, так и
Ras-Raf-MAP-киназные каскады, вызывающие активацию Ets1 и/или E2F
(промотор гена MYC содержит респонсивные элементы для этих
транскрипционных факторов[22,26]).
Многие участники сигнальных
путей, опосредующих в ответ на действие ростовых факторов активацию
циклинзависимых киназ и, следовательно, стимуляцию клеточного деления,
являются протоонкогенами. Изменения их структуры (мутации), приводящие
к ускользанию от воздействия негативных регуляторных факторов и/или
перманентному повышению экспрессии, превращают такие протоонкогены в
онкогены [1,3,5]. Продукты идентифицированных онкогенов представляют
все этажи регуляции митогенного сигнала [5]: ростовые факторы - PDGF-b
(Sis), FGF1 и др.; рецепторные тирозинкиназы - EGF-R (ErbB), HGF-R
(Met), Ret и др.; белки семейства Ras - K-Ras, H-Ras и N-Ras; эффекторы
Ras - серин-треониновые киназы Raf и Mos; транскрипционные факторы -
Jun, Ets1, Myc и др.; и, наконец, циклин D1 (Prad1). Складывается
впечатление, что при детальном анализе в каждом новообразовании
выявляются изменения хотя бы одного из компонентов сигнальных путей
(протоонкогенов), вызывающие перманентную стимуляцию активности
циклинзависимых киназ и инициацию клеточного деления вне зависимости от
действия ростовых факторов.
Интересно, что сигнальный путь
Cdk-Rb-E2F контролируется не только pRB, но и многими другими
супрессорными белками (рис. 2). Некоторые из них являются ингибиторными
субъединицами Cdk (CKIs - Cdk Inhibitors), опосредующими остановку
клеточного цикла в ответ на различные внеклеточные и внутриклеточные
сигналы [16]. Идентифицировано два семейства CKIs: Ink4 и Cip/Kip.
Первое включает четыре представителя, в том числе опухолевые супрессоры
p15INK4b и p16INK4a.
Белки Ink4 обладают достаточно узкой специфичностью: связывая Cdk4 и
Cdk6, они препятствуют образованию их комплексов с циклинами D [16,27].
Семейство Cip/Kip состоит из трех членов: p21WAF1/CIP1, p27KIP1a
и p57KIP2. Эти белки связывают и ингибируют уже полностью
сформированные комплексы циклин D - Cdk4(6), циклин Е - Cdk2 и циклин А
- Cdk2. Кроме того, p21WAF1/CIP1 способен блокировать и комплекс циклин B - Cdc2, ответственный за продвижение по G2-фазе и вход в митоз [16,27]. И p21WAF1/CIP1, и p27KIP1a опосредуют влияние других супрессорных белков. p21WAF1/CIP1
является одной из основных мишеней трансактивационного действия р53, а
следовательно, и супрессоров, участвующих в регуляции
стабильности/активности р53 (p19ARF, АТМ, WT1 [13,14,28,29] или его
транскрипционной активности (BRCA1 и p33ING1 [30-32]). (BRCA1 и WT1
способны активировать p21WAF1/CIP1 также и по неизвестным пока р53-независимым механизмам [31,33]).
Наряду с р15INK4b, p27KIP1a
является ключевым компонентом передачи ингибиторных сигналов,
индуцируемых связыванием TGF-beta со своими рецепторами (Рис. 2).
Недавно обнаружено, что активированные рецепторы TGF-beta фосфорилируют
специфические сигнальные эффекторы, белки Smad2 и Smad3, вызывая их
связывание с опухолевым супрессором Smad4. Образующиеся комплексы
транслоцируются из цитоплазмы в ядро, где они регулируют транскрипцию
специфических генов, в частности ингибиторов Cdk. В результате
активируются и p21WAF1/CIP1, и р15INK4b [34-37]. Последний вытесняет p27KIP1a
из комплекса с Cdk4/6 и подавляет образование их комплексов с циклинами
D, необходимых для продвижения по G1 (рис. 1). Высвобожденный p27KIP1a, в свою очередь, связывает и ингибирует комплексы циклин Е - Сdk2, ответственные за начало S-фазы. Повышение экспрессии p21WAF1/CIP1
также ведет к подавлению активности комплексов циклин D - Cdk4,6 и
циклин E - Cdk2. В результате клетка останавливается в G0/G1 и не
входит в S-фазу (рис 3).

|
Рис. 3.
Cвязывание TGF-b со своим рецептором вызывает образование
транскрипционных комплексов Smad4 - Smad2,3, которые транслоцируются из
цитоплазмы в ядро. Это приводит к активации ряда мишеней, в том числе и
ингибиторов циклинзависимых киназ p21WAF1/CIP1, p15INK4b, p27KIP1a, что вызывает подавление активности Cdk4,6 и Cdk2, ответственных за продвижение по G1 и вход в S-фазу (объяснения в тексте) |
Ингибирующий эффект TGF-beta
преодолевается гиперэкспрессией онкогенов MYC или MDM2 [38]. И если
действие Myc связано с активацией различных Cdk путем повышения
экспрессии Cdc25A [23] и стимуляции деградации p27KIP1a
[24], то белок Mdm2 помимо деградации р53 [13,14] вызывает и
инактивацию pRb [39], высвобождая таким образом активные
транскрипционные комплексы E2F - DP. Следовательно, и гиперэкспрессия
протоонкогенов MYC или MDM2, и инактивирующие мутации в опухолевых
супрессорах Smad4, p15INK4b,
pRb имеют одно общее последствие - клетки ускользают от ингибирующего
действия TGF-b, что представляется очень важным для развития
эпителиальных опухолей, в частности раков кишечника и поджелудочной
железы [40,41].
Одним из наиболее ярких
достижений двух последних лет явилась идентификация еще одного
важнейшего сигнального пути, очень часто нарушающегося в различных
новообразованиях человека и осуществляющего, вероятно, регуляцию
клеточного цикла в зависимости от состояния мембранных и подмембранных
структур клетки [42] (см. рис. 4). Оказалось, что в несвязанном с
E-кадхерином состоянии b-катенин может функционировать как фактор
транскрипции. В цитоплазме он связывается с другим транскрипционным
фактором Tcf4, после чего комплексы b-катенин - Tcf4 транслоцируются в
ядро и активируют гены, имеющие в своем составе специфические
респонсивные элементы. Одними из основных мишеней трансактивационного
действия комплекса b-катенин - Tcf4 является гены циклина D1 [43] и MYC
[44]. Опухолевый супрессор APC, врожденные мутации которого вызывают
развитие аденоматозного полипоза кишечника, связывает свободный
цитоплазматический b-катенин, что вызывает деградацию последнего
[45,46]. Таким образом, инактивация АРС стимулируя образование
комплексов b-катенин - Tcf4, повышает транскрипцию генов циклина D1,
MYC и, как следствие, ведет к активации циклинзависимых киназ,
ответственных за продвижение по G1 и вход в S фазу (рис. 4). К таким же
последствиям приводит и мутации b-катенина, увеличивающие стабильность
его в цитоплазме (такие мутации обнаруживаются у пациентов с семейным
полипозом, не имеющих мутаций APC [43,47]; большинство из них поражает
сайты b-катенина, фосфорилируемые гликогенсинтетазой-киназой-3beta,
GSK-3beta). Сходная картина наблюдается также и при активации
протоонкогена WNT1 (Wingless/INT1) (рис 4). Связывание его продукта
Wnt1 (член семейства цистеин-богатых гликозилированных сигнальных
протеинов) со своим рецептором (Frizzled) вызывает перемещение
цитоплазматического белка Dsh к мембране, где он ингибирует киназную
активность GSK-3b, которая, фосфорилируя b-катенин и APС, стимулирует
их связывание и деградацию b-катенина. Таким образом, индуцируемое Wnt1
подавление активности GSK-3b приводит к стабилизации и повышению
внутриклеточной концетрации цитоплазматического b-катенина, что
повышает вероятность образования активных транскрипционных комплексов
b-катенина с факторами семейства Tcf/Lef1 [48]. Не исключено, что
мутации в гене Е-кадхерина также могут быть ответственны за стимуляцию
сигнальных путей, опосредуемых транскрипционными активностями
b-катенина.

|
Рис. 4.
Мутации опухолевых супрессоров АРС и b-катенина, как и активация
онкогена wnt1, стимулируют образование транскрипционных комплексов
b-катенин - Tcf4, регулирующих гены MYC и циклина D1. В результате
повышается активность ряда комплексов циклин - Cdk (объяснения в
тексте) |
Подводя итоги этого раздела,
заметим, что большинство известных протоонкогенов и опухолевых
супрессоров тем или иным образом регулируют активность циклинзависимых
киназ, ответственных за вход в S-фазу клеточного цикла. Продукты
некоторых из клеточных (Mdm2) или вирусных (Т-антиген вируса SV40, E1A аденовирусов,
E7 HPV и др.) онкогенов связывают и инактивируют основной субстрат
таких Cdk - pRb. По-видимому, нарушения в сигнальных путях >
Cdk2,4/6 > pRb > E2F/DP являются необходимыми для появления
постоянно пролиферирующих неопластических клеток.
|