Микробы и растения: молекулярный диалог в андеграунде

Мы многое не умеем или не можем делать в одиночку – достаточно вспомнить пустой холодильник или гору белья во время отсутствия жены, чтобы понять, что одинокое существование не дает возможности полностью себя реализовать.

Это один из примеров сотрудничества между людьми, которое часто имеет сложные, даже причудливые формы. Не менее сложно сотрудничество при симбиозе – хорошо известном в природе явлении, под которым понимают взаимополезное существование двух или более живых существ.

Растения, лишенные возможности пользоваться услугами микроорганизмов, с которыми они прошли долгий и сложный путь эволюции, часто оказываются весьма беспомощными в этом мире. одна из наиболее важных потребностей растений – потребность в азоте.

На корнях бобовых растений легко различить образования самой разной формы – клубеньки. на срезе они имеют ярко-красный цвет благодаря ферменту леггемоглобину, который, так же как и его ближайший родственник – гемоглобин крови, регулирует поступление кислорода и защищает от разрушающего воздействия нитрогеназу – один из наиболее сложных природных ферментов. Он переводит недоступный живым существам атмосферный газообразный азот в “съедобную” форму иона аммония NН4+. Некоторые бактерии могут заниматься этой деятельностью в одиночку, обеспечивая азотом только себя, другие же предпочли передать съедобный азот растениям. В благодарность за такой дефицитный и незаменимый азот растение предлагает микроорганизмам пищу и кров.

Пример бобовых показывает как выигрывает тот, кто способен на конструктивное сотрудничество. Однако и другие эукариоты без минерального азота обойтись не могут. Поэтому во всех программах по генетической инженерии задача создания небобового растения, способного фиксировать азот, стояла как приоритетная.

Без хорошего знания молекулярно-генетических механизмов невозможно ни регулировать симбиотические, ни создать принципиально новые взаимоотношения. Поэтому важно разобраться, какие гены растений задействованы в этом процессе.

До встречи и у бактерий, и у растений гены, определяющие взаимодействие, молчат – оба потенциальных партнера могут питаться минеральным азотом и выжить друг без друга. Но когда они встречаются, в почве происходит молекулярный диалог, механизм которого прояснился лишь совсем недавно (рис. 1). Растения сигнализируют о возможности вступить в симбиоз с помощью специальных молекул – флавоноидов, специфических для каждого растения. Флавоноиды привлекают клубеньковых бактерий, которые воспринимают эту химическую информацию с помощью специального белка нодД, синтез которого кодируется специальным геном. Белок, расположенный на мембане бактерий, воспринимает только конкретный флавоноид (по принципу “ключ–замок”), а приняв сигнал, дает команду на запуск работы генов, которые ответственны за взаимодействие с растением.

Ошибка при идентификации партнера быстро приведет к перерасходу энергии и гибели клеток, поэтому бактерия придирчиво отбирает союзника. Зато отобрав его, она действует наверняка. Было показано, что гены бактерий, заставляющие растение создавать клубенек, делают это путем синтеза одного из наиболее эффективных стимуляторов деления клеток – нод-фактора (олигосахарида), который в растениях служит сигналом к делению клеток корня и формированию тканей клубенька.

Общая структура центральной части молекулы олигосахарида одинакова у всех бактерий, поэтому и бактериальные гены получили название общих нод-генов. Однако молекулы нод-факторов у разных бобовых отличаются своеобразным “декором”: наличием сульфогрупп, ацетатных или карбамоильных группировок и т.д. Возможно, эти различия помогают бактериям определять свой вид растений, если рецепторы у разных бобовых разные или защитная система растения не пропустит фактор, декорированный несоответствующим образом. Но если различается “декор”, то различаются и гены, которые этот “декор” контролируют у разных групп бактерий, за что они и получили название генов хозяйской специфичности. Определенные сведения о механизме образования и действия таких сигналов (сигналлинга) можно получить, изучая роль растений в процессе узнавания.

Материалом, позволяющим по-новому взглянуть на эту проблему, послужили генетические линии гороха с наследственно измененной способностью к взаимодействию с бактериями. Согласно закону Н.И. Вавилова искать различия в признаках растений лучше всего в местах их происхождения, а для гороха – это Ближний Восток. В случае с клубеньковыми бактериями логика Вавилова также оправдалась – известно, что формы афганского происхождения не образуют клубеньки в наших почвах.

Изучив несколько сотен форм, проанализировав тысячи растений на способность к симбиозу, мы среди растений афганского происхождения отобрали несколько линий, которые отказывались узнавать сродственные обычным горохам клубеньковые бактерии.

Рис. 2. Увеличение нитрогеназной активности при предварительной обработке штаммов флавоноидом-индуктором и без такой обработки. После обработки интенсивность азотфиксации возрастает, что, вероятно, является следствием более успешной конкуренции бактерий. Данные предоставлены Н.М. Макаровой

Профессор Ли из Вагенингена, разрабатывая эту же проблему, пришел к выводу, что из мест происхождения экзотических горохов можно выделить бактерии, способные вызывать образование клубеньков на их корнях. Выделенный им штамм бактерий ТОМ стал практически единственным, на котором во всем мире принялись изучать феномен внутривидовой специфичности. В частности выяснили, что нод-фактор из штамма ТОМ имеет несколько иную структуру – он содержит дополнительный ацетат. Кроме того, бактерии этого штамма продуцируют очень мало фактора, на основании чего предположили, что, возможно, пониженное количество нод-факторов не способно “включить” защитные механизмы растения и бактерии штамма ТОМ преодолевают барьеры, недоступные для других. Мы также интенсивно занялись афганскими горохами, стремясь решить проблему избирательного заражения.

Обычно в почве содержится огромное количество клубеньковых бактерий, которые наперебой предлагают свои услуги растениям. Часто бывает, что наиболее прыткие оказываются далеко не самыми эффективными по способности к азотфиксации, ради чего, собственно, и устанавливается симбиоз. Отселектированные же в лаборатории штаммы слишком изнежены, не столь быстро образуют клубеньки. Поэтому щепетильность афганских горохов в выборе бактерий очень интересна. Совместно с коллегами из Вагенингена было установлено, что избирательное заражение у афганских горохов контролируется разными аллелями одного и того же гена sym2. Аллели этого гена ввели во вновь создаваемые сорта гороха и добились того, что сорта полностью игнорировали, на манер гордых афганцев, все отечественные штаммы клубеньковых бактерий.

Однако какими-то бактериями эти горохи необходимо было инокулировать. Штамм ТОМ для этого, к сожалению, не годился. Он обладал совершенно необъяснимым признаком – пугаться других штаммов и не образовывать клубеньки в их присутствии. А эти другие вели себя подобно собаке на сене. в результате клубеньков вообще не было, причем в этом странном явлении явно участвовало само растение. Положение спас штамм, ранее выделенный из наших почв, которому было все равно, какие горохи перед ним и кто его окружает, он исправно образовывал клубеньки. При совместной инокуляции с любым из обычных штаммов на афганских горохах почти 100% клубеньков были образованы только этим штаммом А-1. Однако когда мы его смешали со штаммом ТОМ, последний совершенно неожиданно проявил характер и, оккупировав корни, дал до 40% клубеньков. Почему-то он абсолютно не боялся своего мощного собрата. Анализ сигнального механизма штамма А-1 показал, что афганские горохи имели такие же сигналы, что и отечественные сорта горохов, дело, видимо, в бактериях. А-1 выделял огромное количество нод-факторов, и штамм ТОМ по сравнению с ним выглядел инвалидом. Кроме того, спектр этих факторов был весьма разнообразен и включал также нетипичные нод-сигналы, отличающиеся по строению от ранее известных. Поскольку анализ чистых культур не давал оснований подозревать конкуренции между штаммами, была предложена теория, которую легче понять, продолжив сравнение с собакой. Теперь в роли этого животного необходимо представить себе защитную систему растения, спящую до появления подозрительных нод-факторов – олигосахаридов, которые “шумною толпою” бросаются на штурм корня. При их наличии активируются ферменты, разлагающие олигосахарид, и уничтожают всех, кто не имеет соответствующего пропуска – декора, характерного для привычных бактерий – нормальных симбионтов. В такой ситуации определенное преимущество получит такой штамм (ТОМ), который не будет ломиться с толпой на спящего пса, а попробует в одиночку потихоньку проникнуть в дом, не разбудив собаку. Отсюда следует, что совместно с другими штаммами, производящими большие количества олигосахаридов, без соответствующего декора сделать это ТОМу не удается. Его спутник и активировал систему защиты, которая уничтожала все факторы, в том числе и небольшое количество нод-варианта штамма ТОМ. В результате до мишени – корня – никто не добрался и клубеньки не образовались. В отношении же штамма А-1 можно допустить, что он вырабатывает так много фактора, что это количество не удается разрушить даже активированной системе корневой защиты – толпа оказывается слишком велика для одной собаки. Однако почему же штамм ТОМ при совмещении с А-1 успешно преодолевает барьер? Видимо, дело в том, что нод-фактора А-1 не просто слишком много, он способен каким-то образом подавлять или усмирять защитную систему растения.

Таким образом, логично предположить, что процесс узнавания растением бактерий происходит на двух уровнях – проникновения нод-фактора через защитные барьеры корня, а затем при распознавании, когда достигающий рецептора фактор соответствует ему по структуре.

Таким образом, знание механизма обмена сигналами позволяет регулировать взаимоотношения растения и бактерий. Но если мы знаем сигналы, то почему бы не воспользоваться этим. На практике удалось значительно повысить интенсивность азотфиксации в клубеньках, если до этого бактерии были обработаны сигнальным соединением (рис. 2).

Анализ взаимодействия растения и бактерий на более поздних стадиях поставил вопрос – как растение определяет дальнейшую судьбу своего партнера.

Клубеньковая бактерия из почвы, вступая в симбиоз, из свободного обитателя ризосферы превращается в рабочую лошадку – азотфиксатора. При этом форма бактерии часто меняется – она превращается в огромный мешок – бактероид, буквально набитый ферментом нитрогеназой, которая составляет до 40% веса этого новообразования. Строго определенное число бактероидов отделяется от цитоплазмы растения-хозяина сложной системой мембран, образуя симбиосому (рис. 3).

Некоторые представления о том, как растение контролирует образование симбиосом, были получены при работе с мутантами гороха по симбиозу, которые мы выделили, используя специальную среду выращивания, содержащую все необходимые растению элементы, кроме азота. При отборе те растения, которые не были способны воспользоваться услугами клубеньковых бактерий, явно отставали в росте, были желтого цвета, а будучи помещенными на полноценную среду, дорастали до семян. Был получен ряд мутантов, например с клубеньками белого цвета, без леггемоглобина. Один из мутантов оказался уникальным и никогда ранее не встречался, он получил название Sym31 (рис. 4). Его симбиосомы содержали не один бактероид, как это обычно бывает у гороха, а от двух до восьми штук. Оказалось, что растение “считает”, сколько клеток окажется в одной симбиосоме. Кроме того, бактерии в симбиосоме, казалось, и не собирались фиксировать азот и по внешнему виду ничем не отличались от свободно живущих почвенных форм.

Значит, процесс образования симбиосом многостадийный и контролируется растением. Если его прервать на ранней стадии, то гены растения, контролирующие последующие этапы, не включатся и мутантное растение по целому ряду характеристик, в том числе и по внешнему виду, будет отличаться от нормы. Гены sym, скорее всего, выступают в роли координаторов группы ферментов, которые осуществляют метаболизм азота, уже ассимилированного в съедобную для растений форму. Один из таких генов контролирует активность специфичного для клубеньков фермента аспартатаминотрансферазы, которая резко подавлена в мутанте sym31.

Полученные результаты вполне объяснимы. Данный фермент нужен для переноса между аминокислотами уже зафиксированного азота. Но азота в аммонийной форме еще нет, так как бактериальная нитрогеназа не работает, поэтому растение оберегает себя от бессмысленной траты энергии.

Поняв, как работают sym гены, мы не только уясним механизм азотфиксации, но и получим возможность представить себе, как вообще регулируют гены процесс развития симбиотических отношений.


Рис. 1. Общая схема сигналлинга при установлении симбиоза между бактериями и бобовыми растениями. Специфические флавоны гороха (а) посредством гена нодД (б) активируют процесс транскрипции общих симбиотических генов бактерий (в), которые синтезируют центральную часть нод-фактора (г), а также генов хозяйской специфичности (е, д), декорирующих нод-фактор разными группами. Отличительные характеристики нод-факторов штамма ТОМ – наличие ацетильной группировки (е), у штамма А-1, кроме того, имеются различия в структуре жирной кислоты (д)

Словарь терминов

Леггемоглобин – фермент, состоящий из белковой части растительного происхождения и гема. Вырабатывается только в клубеньках бобовых, обладает способностью связывать кислород. Семейство подобного рода белков, весьма сходных по структуре, выполняет эти функцию также у животных и насекомых.

Нитрогеназа – фермент микробного происхождения, способный восстанавливать тройную связь в молекуле газообразного азота. Его наличие является обязательным условием биологической фиксации азота.

Флавоны (флавоноиды) – циклические соединения, широко представленные у растений и выполняющие самые различные функции, в т.ч. являются предшественниками пигментов, стеринов, фитоалексинов. Синтез их меняется под воздействием различных факторов. Ряд флавонов и флавоноидов, находящихся в корневых выделениях, специфичны для данного вида бобовых и способны активно влиять на работу генов клубеньковых бактерий.

Нод-факторы (олигосахариды) – небелковые вещества микробного происхождения, построенные по единому плану – центральная хитиноподобная часть, состоящая из нескольких остатков сахаров и периферийные группы, которые различаются у разных форм клубеньковых бактерий. Нод-фактор способен запускать деление клеток растений, а в меньшей концентрации вызывает скручивание корневых волосков.

Нод-гены – гены клубеньковых бактерий, придающие последним способность вызывать образование клубеньков на бобовых растениях. Нод-гены разделяются на две группы – общие нод-гены, сходные у всех клубеньковых бактерий и контролирующие биосинтез центральной части нод-фактора, и гены хозяйской специфичности, контролирующие периферические части молекулы нод-фактора и различающиеся у разных видов и штаммов клубеньковых бактерий.

Клубеньковые бактерии – почвенные бактерии, способные вступать в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями (образовывать клубеньки). Подразделяются на виды в зависимости от своей специфичности.

Специфичность клубеньковых бактерий – свойство образовывать клубеньки только у определенных растений-хозяев.

Сигналлинг – процесс последовательной выработки партнерами по симбиозу соединений, способных индуцировать прохождение последующих стадий взаимодействия.

Инокуляция – процесс искусственного внесения бактерий в корневую среду растений с целью образования клубеньков.

Рецептор – в данном случае структура или молекула, способная менять свое состояние при взаимодействии с нод-фактором, в результате в центральной части корня индуцируется деление клеток.

Бактероид – продукт превращения бактерии внутри корня в процессе образования азотфиксирующего аппарата. Превращаясь в бактероид, бактериальная клетка увеличивается, часто изменяет форму, в клетке происходит увеличение количества ДНК, белков, особенно возрастает содержание нитрогеназы – до 40% от общего веса. Бактероид – способен фиксировать азот.

Симбиосома – новообразование в растительной клетке, находящейся в клубеньке. Симбиосома состоит из определенного числа бактероидов, окруженных мембраной сложного происхождения.

И.А. Тихонович,
Всероссийский НИИ
сельскохозяйственной микробиологии,
г. Пушкин

Другие записи

10.06.2016. Морковь
Будем предельно почтительны при обращении к благородному овощу, моркови культурной, Daucus carota L., к западному ее подвиду, каротиновой разновидности, каковую мы обычно едим в супах, салатах и просто…
10.06.2016. О пользе чайного листа
Бодрящий, тонизирующий чай горячо любим и почитаем в России. Чайное растение появилось в нашей стране в первой половине прошлого столетия, а само чайное производство зародилось в Китае еще за несколько…
10.06.2016. Растения, удобные для изучения на уроках ботаники (Подсолнечник, Кукуруза, Земляника, клен)
Подсолнечник масличный (Helianthus annuus) - хорошо известное растение из семейства сложноцветных. Крупные размеры подсолнечника и отдельных его органов, доступность посевного материала и простота культивирования…
10.06.2016. О разнообразии органов растений
Использование комнатных растений в качестве демонстрационного материала при изучении разнообразия органов растенийКОРНИЗапасающиеХлорофитум (Chlorophytum comosum). При пересадке этого растения по краям…
10.06.2016. Определение листопадных деревьев зимой
При распознавании листопадных деревьев в зимнее время обычно пользуются специальными определительными таблицами (определителями). Определители особенно необходимы тем, кто не имеет возможности обратиться…